Ông sinh ngày 20 tháng 9 năm 1945 tại giáo xứ Ðại Lãm, nay thuộc xã Tam Dị, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang, thuộc giáo phận Bắc Ninh. Bảy ngày sau, cậu được rửa tội tại nhà thờ của giáo xứ. Cha ông là ông Giuse Nguyễn Văn Tô (? – 27 tháng 3 năm 1983) – một nhà giáo từ năm 1954, phục vụ công tác giảng dạy trong các trường nhà chung. Mẹ ông là là bà Anna Nguyễn Thị Ðể. Giám mục Nguyễn Quang Tuyến là người con thứ hai trong gia đình có 6 anh em: bốn trai, hai gái. Thuở nhỏ, cậu bé Tuyến tỏ ra là một cậu bé chăm ngoan, chịu khó học tập và năng dự lễ, cậu còn yêu mến Thánh Maria.[2]

Trong thời gian học tiểu học, cậu Tuyến là một học sinh thông minh, có chí hơn người và thường xuyên đứng đầu lớp. Tháng 8 năm 1957, cậu bé Tuyến bắt đầu con đường tu học của mình bằng cách nhập học tại Tiểu chủng viện Thánh Gioan Hà Nội. Tại đây, chủng sinh Tuyến luôn gương mẫu, say mê học tập, tu luyện. Năm 1960, chủng sinh Giuse Tuyến tạm lánh Tiểu chủng viện về quê là Ðại Lãm. Trở về quê, cậu chủng sinh Nguyễn Quang Tuyến tiếp tục học văn hóa và tốt nghiệp Phổ thông Trung học năm 1964, đồng thời vẫn còn giữ ý định tu trì. Sau khi tốt nghiệp, vì hoàn cảnh chiến tranh hết sức khó khăn, ông lao động trên nông trường và âm thầm theo học môn Thần học, do chính Giám mục Bắc Ninh Phaolô Giuse Phạm Đình Tụng hướng dẫn.[2]